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挑选婚纱照相框必须了解的小知识

2021-04-02 06:26:45
浏览: 97次 来源:【jake推荐】 作者:-=Jake=-
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荧光原位杂交(FISH)检测是临床病理检测中广泛运用的一种分子细胞遗传学诊断技术,在标本处理、检测步骤、结果判读、质量控制等各个环节实现检测的规范化和标准化,对提高检测的准确性和降低室间差异具有重要的现实意义,同时也为辅助病理诊断和预测临床靶向治疗的疗效提供更为准确的依据。

荧光原位杂交是依据碱基互补原理亚博代理 ,应用荧光素直接或间接标记的核酸探针,在组织切片、细胞涂片、染色体铺片上检测间期细胞核染色质数量及结构变化,进行定性和相对定量的分析检测技术。荧光原位杂交主要用于病理的辅助诊断及鉴别诊断、疾病预后评估和指导临床靶向治疗等,是近十年来在临床病理检测中运用最为广泛的一种分子细胞遗传学诊断技术。

一、荧光原位杂交检测的组织处理

国内发表的临床诊疗指南及共识中都涉及对组织处理的要求,技术人员应及时了解并掌握最新进展,并根据国内检测指南的更新而做出调整。

一)标本类型

1、遗传病:外周血、羊水、绒毛、胎儿脐带血制备的染色体,或羊水和绒毛的间期细胞。

2、血液病:外周血或骨髓的染色体或间期细胞。

3、实体肿瘤(包括骨髓活检):理论上讲,任何含有足够癌细胞或DNA的组织、细胞或体液(如胸水、腹水等)标本都可进行相应的基因状态检测,但必须依据相应现行的临床诊治指南来选择。

二)标本固定

1、遗传病和血液病(除石蜡包埋骨髓活检标本外):染色体或细胞制片后,50~60℃烤片2小时。

2、细胞学标本:细针穿刺标本,取样后应立即95%乙醇固定;胸、腹水标本取样后,优先建议沉渣包埋制备细胞蜡块,离心后,95%乙醇或3.7%中性缓冲甲醛液固定;对于细胞量过少或不具备制备蜡块条件的实验室,取样涂片后立即95%乙醇固定。

3、组织学标本:组织离体后尽可能在30~60分钟内将组织按规范剖开,置于不少于自身体积4~10倍的3.7%中性缓冲甲醛固定液(pH7.2~7.4)中固定6~72小时【1-4】。固定液的pH值会直接影响蛋白及核酸的含量【1,2】。组织学标本过度固定或固定不足都会导致检测结果的变化。

三)标本脱钙

骨组织及钙化病灶固定后,需要先将钙盐除去使组织软化,以便于后续的临床检测。传统的脱钙剂(盐酸)会显著降解DNA和RNA,无法保证荧光原位杂交检测结果的准确性,脱钙剂乙二胺四乙酸(EDTA)可以在脱钙过程中保护DNA,但脱钙时间会延长至48小时【5,6】。

四)组织脱水、透明、浸蜡

实验室需根据自身的实际情况,通过严格的测试亚博app ,制定标准化的组织脱水、透明、浸蜡流程以及试剂更换程序。建议使用自动组织脱水机和梯度乙醇脱水方案,如70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇×2→无水乙醇×2。根据处理的组织类型和大小以及脱水机的工作效率,每种梯度的乙醇作用时间可设定为60~120分钟。根据处理组织的数量和试剂使用时间及时进行更换,脱水时间不足或试剂更换不及时均会导致后续染色、杂交效果不佳。

五)组织切片

根据检测要求石蜡切片厚度为3~5μm,贴于阳离子或正电荷(或类似的)等专用防脱载玻片上,确保切片与载玻片间没有气泡。切片在空气中略微干燥后应立即烤片,推荐标准温度为65℃烤片不少于2小时。荧光原位杂交未染色的切片置于室温不宜超过6周【3,7】。

二、荧光原位杂交检测步骤

荧光原位杂交检测根据检测标本的不同,操作步骤略有差异,主要流程包括:预处理、变性/杂交、杂交后清洗等环节。荧光原位杂交新项目开展之前,应进行包括方法学及试剂等性能验证,建立符合实验室的标准化操作流程凤凰彩票app ,以确保结果的准确性。

一)脱蜡

烤好的组织切片需经过脱蜡处理,二甲苯脱蜡不足会导致探针杂交强度和杂交效率降低、荧光背景高等钱柜体育 ,影响实验结果。因此脱蜡使用的二甲苯必须及时更换,通常至少每两周更换一次,并可根据实际情况延长脱蜡时间;脱蜡过程中产生的有机废物需进行回收处理【8-10】。

二)预处理/酶消化

1、切片预处理:在现阶段,预处理常见试剂有1mol/L硫氰酸钠、30%酸性亚硫酸钠、10mmol/L柠檬酸、去离子水等;处理方法有高温水浴、高温高压等;预处理温度50~120℃不等。处理程序会因组织类型不同而有差异。

2、酶消化处理:对切片进行酶消化,常用的蛋白水解酶有胃蛋白酶和蛋白酶K。不同批号、不同厂商的胃蛋白酶活性不同,消化能力也存在一定的差异。酶消化的作用是分解包围靶DNA的蛋白质,以增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号。酶消化注意事项:①酶的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高,会对细胞的结构有一定的破坏,细胞核消失或细胞核辨认不清,也会造成一定程度的组织脱片;②酶消化不足会造成蛋白消化不透彻,降低组织的通透性以及杂交信号的强度和杂交率;③消化酶均为现用现配,且工作液使用时间

3、梯度乙醇脱水:将组织切片依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2分钟脱水,自然晾干。注意事项:切片必须充分脱水晾干,避免造成信号减弱或者杂交失败。

三)探针的应用

1、探针的配制:国内常用的探针有即用型和非即用型,即用型探针可直接点样杂交,操作简便。非即用型探针是需要操作者将探针与杂交缓冲液按一定比例配制,配制方法参照探针厂商说明书。注意事项:①探针不宜反复冻融,可适当分装;②震荡旋涡时需轻柔;③充分混匀,如果混匀不均银河体育 ,会导致杂交信号微弱或无信号【3,8,9】。

2、探针的加样:参照选用厂商推荐或经过本实验室有效性验证纳入标准化操作流程文件的探针加样量,加到待杂交组织中央处,使用合适的盖玻片,橡胶水泥密封四边。注意事项:①探针的使用和配制遵照本单位选用试剂的产品说明书操作;②盖玻片一般采用硅化盖玻片或无菌的蜡膜;③注意环境光强度,避免太阳光或强烈的光照;④加盖玻片时注意不要留有气泡,避免因气泡造成干片现象,导致无杂交信号或杂交率降低;⑤盖玻片边缘封胶不严密也会出现干片现象。

3、变性及杂交:变性和杂交分为甲酰胺变性杂交(手工操作)和杂交仪变性杂交(自动操作)。前者是将组织切片和探针分开进行变性,后者是在杂交仪中对组织切片和探针共变性,此方法可以在一定程度上降低人为因素的影响。根据所选用厂家探针的要求,设定共变性杂交条件,可选变性温度和时间:72~95℃,3~5分钟,杂交温度和时间:37或42℃,16~18小时。注意事项:为避免杂交液在变性和杂交过程中的损失及防止干片,一定要在盖玻片的四周用橡胶水泥进行密封。

4、杂交后处理:杂交后处理的目的:①洗去多余的未结合的探针;②洗去非特异度结合的探针片段,有效降低杂交背景。杂交后洗涤一般遵循的共同原则:盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。可选择的洗液有0.3%NP-40/2×SSC溶液、0.1%NP-40/2×SSC溶液、50%甲酰胺/2×SSC等,具体请参照相应厂家的试剂说明书。注意事项:①在漂洗的过程中,切勿使切片干燥;②影响洗涤的因素有:洗液中NP-40的浓度、洗涤时间、洗涤温度、洗液pH值【10,13-15】。

5、对比染色、封片:在杂交区域位置滴加足够量的DAPI复染剂,立即盖上盖玻片荧光原位杂交,-20℃冰箱内存放。注意事项:①4,6-二咪基-2-联苯基吲哚(DAPI)是一种毒性物质与致癌物,操作过程中应注意个人防护措施。如不慎接触,立即大量水冲洗【11,13】。②注意避光,紫外线会造成荧光淬灭。③宜选用较大盖玻片或是选用指甲油在盖玻片四周封片。可以有效避免阅片时镜油的渗入对信号观察的影响。荧光原位杂交结果应立即照相存档并将切片置于-20℃保存,建议至少保存3个月备查,有条件的可以保存1年以上,仍可见清晰信号【3,7】。

三、结果判读

为尽可能减少荧光原位杂交计数的人为误差,建议每例标本的荧光原位杂交切片至少由两名有资质的检验/检查人员计数判读,特别是出现荧光原位杂交结果不确定时【3,16】。

由于荧光原位杂交探针杂交的区段长,在组织或细胞块切片中,可能出现人为的信号异常,如缺失、分离等。所以必须在一定数量的细胞中(20、50或100个细胞)计数杂交信号,当具有阳性信号的细胞数达到一定数值时,检测标本才能视为阳性,这一数值即为阈值(临界值,通常为阳性信号的细胞百分比)。阈值设定:参照行业指南/共识、探针试剂说明书或实验室自设阈值(所有标本的检测结果计算,算术平均数 3倍的标准差定为该指标的阈值),经实验室验证后使用,验证方法参照方法学验证。

对于辅助临床诊疗的荧光原位杂交检测,其阈值设定需要考虑因素包括。

1、探针的灵敏度和特异度:综合考虑探针类型(如分离探针、计数探针等)、长度(位点特异性探针、着丝粒探针等)、来源(不同厂家不同的实验条件要求)等,进行室间评估验证,其一致性应在95%以上【17】。

2、技术方法的灵敏度和特异度:与已知方法相比,确认可检出的最少异常细胞数和异常细胞数的阳性检出率。

3、临床应用的有效性:指在确认探针和方法的有效性后临床应用的效果,需要大量临床数据积累。目前,已有临床指南的荧光原位杂交探针应用项目包括:乳腺癌HER2基因的荧光原位杂交检测,参考指南是《乳腺癌HER2检测指南(2019版)》【3】;胃癌HER2基因的荧光原位杂交检测,参考指南是《胃癌HER2检测指南(2016版)》【4】;肺癌ALK基因的荧光原位杂交检测,参考指南是《中国间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性非小细胞肺癌诊疗指南(2015版)》【18】。此外,上述与临床诊疗相关的荧光原位杂交检测项目在更新中,应根据指南的变更做出调整。

4、由于肿瘤细胞染色体改变的复杂性,可能出现与预期有差异的信号改变(即不典型杂交信号):如染色体易位分离探针检测出基因扩增的信号,或者参考染色体信号丢失或增多,这时应结合病史、病理特征及探针信息综合分析,参考文献给予合理解释。

对于常用探针类型检测的结果判读,一般的要求是:①基因扩增:单色探针通常计数每个肿瘤细胞信号的绝对量,而双色探针则计算每个肿瘤细胞靶基因位点信号与参考染色体信号的比值。②染色体易位:可发生在染色体内(以分离探针信号之间达到1~2倍信号直径的间距判定易位)或染色体间(一般必须有清楚的独立信号)。少数情况下,易位也可出现其中一个分离探针信号的丢失。③基因缺失:在应用单色探针(即没有参考染色体探针)时,需要增加计数细胞的数量,避免由于切片导致的信号缺失而判读为阳性结果。④双色探针以上的多色探针对其中的每种信号可以有不同的阈值要求。

四、质量控制

荧光原位杂交质量控制是指采取不断优化的措施和技术以及制定实验室制度和工作规范,完善实验室操作流程与步骤,保证荧光原位杂交染色质量达到最佳结果,并可以做出准确诊断。荧光原位杂交质量控制贯穿于检测的全流程。荧光原位杂交检测过程中任一步骤的调整及试剂的更换均应记录在案,并进行相应的性能验证。荧光原位杂交质量控制包括室内质控和室间质量评价(简称室间质评)。

一)室内质控

荧光原位杂交实验室内部的质量控制,包括试剂质控、人员质控、设备及场地质控、荧光原位杂交实验流程的质控。

1、人员质控:实验室应至少具有2名检验/检查人员【19】,根据病理实验室主管部门相应法律法规要求,参与荧光原位杂交染色的病理技术人员应具备分子生物学或相关专业学习背景,由相应资质的培训机构经过一定的荧光原位杂交理论岗前学习培训和实际操作培训,并通过相关培训考核合格方可上岗。对于使用全自动及半自动染色设备的操作人员,同时还应具备染色设备的使用维护上岗资格。已获得上岗资质的人员每年应进行一次科内能力评审。对新进员工在最初6个月内应至少进行2次能力评审,保存评估记录。当职责变更时,或离岗6个月以上再上岗时,或政策、程序、技术有变更时,应对员工进行再培训和再评估,合格后才可继续上岗【19】。实验室应建立人员档案,并制定人员年度培训及定期考核计划。

2、试剂质控:①新试剂入院,应遵循医院新试剂入院流程,其中靶向相关指标的检测试剂应按照2017年12月国家食品药品监督管理总局对相关试剂的要求选择(如HER2荧光原位杂交探针,需要具备三类试剂证)。入院后新开展的项目应进行性能验证,包括方法学验证及试剂验证。方法学验证包括检测方法的准确性、稳定性以及重复性。参考国家医药行业标准YY∕T1261-2015HER2基因检测试剂盒(荧光原位杂交法)【20】,按本实验室建立的方法制备相应数量的玻片,检测结果由两人同时评估,重复两次,评价在不同判读者和不同标本间的重复性,以保证方法的准确性和重复性。②试剂性能验证:当已经验证的检测方案出现任何一种变化时,实验室应利用至少2例已知阳性标本和2例已知阴性标本对检验方案进行性能验证,验证结果一致后荧光原位杂交,记录在案后方可使用。③试剂质控:经过筛选的可靠试剂购入实验室后,应立即进行试剂验收并在最短时间内进行试剂性能验证。④组织处理的质控:标准的组织前处理是获得合格原位杂交制片的前提,组织的前处理过程涉及病理科取材、固定、制片多个环节。组织处理应严格按照实验室相关标准化操作流程文件的要求进行。⑤相关设备质控:包括设备使用人员、设备所处环境条件、相关设备、使用/维护等。⑥荧光原位杂交切片质控:包括切片厚度、切片时间以及切片的脱蜡等步骤。⑦对照设置:设置对照(包括设置阳性对照、阴性对照)是验证操作步骤是否正确、染色结果是否准确的关键。对于与肿瘤靶向药物治疗相关的检测项目(如HER2、ALK等),必需设置对照。对照的设立应参照国内检测指南/专家共识设置,对于没有指南/共识的项目应设立阴性及阳性对照,以确保结果的可靠性。

二)室间质评

室间质控是指为确保实验室维持较高的检测水平而在不同实验室之间对其能力进行考核、监督和确认的一种验证活动,主要是为了检查操作和实验室的实验条件是否过关。新开展荧光原位杂交检测的实验室阴性和阳性的检测结果必须与合格的参考实验室结果达到95%的一致性【20,21】。建议每个生物标志物每年应至少参加一次全国或省市以及权威机构组织的室间质评【3】,并将室间质评结果进行分析存档。国际上的包括美国病理医师学会(CAP)、欧洲分子基因诊断质量联盟(EMQN)和英国实验室间质量评定组织(UKNEQAS)等。国内的包括中国合格评定国家认可委员会(CNAS)、国家病理质量控制中心(PQCC)等。对于没有室间质评的生物标志物检测项目或由于每年发放的质控品有限,建议没有申请到的单位可以与通过PQCC、CNAS等官方室间质评的实验室之间做室间比对。

参考文献

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